纳米孔测序是一种独特、可扩展的技术，能够对任何长度的 DNA 或 RNA 片段进行直接、实时分析。该技术在核酸通过蛋白质纳米孔时监测电流变化，以此来发挥作用。所得信号经过解码，可得出特定的 DNA 或 RNA 序列。

纳米孔测序应用领域

1）病原微生物

     病原宏基因组、多重靶向病原体、微生物耐药性、微生物全基因组，NTS病原体检测，菌群结构检测，基因组组装检测等

2）靶向测序

     扩增子和无 PCR 富集、通过适应性采样实现实时靶向测序、16S rRNA 分析、变异分析：结构变异、单核苷酸变异 (SNV)、定相、碱基修饰

3）RNA 、cDNA，PCR-cDNA测序

    直接 RNA、直接 cDNA 和 cDNA 测序、对全长转录本进行表征和定量、对完整病毒基因组进行测序、变异分析：剪接变体、基因融合、SNV、碱基修饰

4）表观遗传学、表观转录组学

     碱基修饰（例如甲基化）、组蛋白修饰、非编码 RNA 活性（例如 lncRNA）

5）宏基因组学

     对混合样本进行实时、无偏倚分析、使用长读长 提高种属鉴定能力

6）微生物快速鉴定

      可以在采集点直接进行测序，实时得到序列信息进行物种分类鉴定，完成微生物的快速鉴定

7）全基因组测序

     从头组装和重测序、Scaffolding 和完成图、变异分析：结构变异、单核苷酸变异 (SNV)、定相、碱基修饰、染色质构象

8）基础基因组学、环境基因组学、动植物基因组学、单细胞转录组学

纳米孔测序应用案例

1）2023.10《Nature》Oxford Nanopore纳米孔实时快速测序 + 人工智能AI分析，在20-40分钟内确定外科手术中小儿脑肿瘤类型

荷兰乌得勒支大学研究人员在《Nature》杂志上，推出开创性的“Sturgeon ”神经网络：利用Oxford Nanopore的DNA实时快速测序技术 + AI深度学习，展示了他们在手术过程中对中枢神经系统肿瘤进行实时的分子分类。

1、“Sturgeon ”是一个经过训练的深度学习神经网络，可根据稀疏甲基化图谱对中枢神经系统肿瘤进行分类。

2、Oxford Nanopore的快速纳米孔测序技术可以准确、实时地识别这些图谱，为了解肿瘤的分子特征提供重要依据。

3、通过这两项创新技术结合，从活检到确定肿瘤的整个过程所需的时间：从一周大幅缩短到 60-90 分钟。

4、这一进步的重大意义在于，它有可能让外科医生在手术过程中根据肿瘤的具体特征调整手术方法和技术，有可能改变神经外科手术的决策。

2）2021.11 《Science》杂志：蛋白质测序突破！纳米孔实时快速测序技术，直接测序法准确率100%！可以识别氨基酸修饰！

荷兰代尔夫特理工大学的研究人员：《Science》上发表《利用纳米孔在单氨基酸分辨率下对单蛋白质的多次重读》：通过纳米孔测序技术成功扫描并读取了单个蛋白质的氨基酸序列：线性化的DNA-肽复合物缓慢通过微小的纳米孔（非常灵敏-改变单个氨基酸也能检测到），研究人员可以根据当前信息含量的变化和强度读取相关蛋白质，直接对蛋白质的氨基酸序列进行排序。更重要的是，这个过程不影响肽链的完整性，可以对单个肽链进行反复读取，然后拟合所有的数据，从而获得基本100%的准确率的肽链序列组成。

传统的的蛋白质测序价格昂贵，且无法检测到许多稀有蛋白质。Oxford Nanopore 单细胞纳米孔实时测序技术，解决了上述难题，为蛋白质测序提供了新的更好解决方法。

3）2022.7 《Nature Nanotechnology》：通过纳米孔实时快死测序技术，利用苯硼酸修饰的异源八聚耻垢分枝杆菌孔蛋白A纳米孔，精确识别11种核昔单磷酸，准确度达到0.996！

南京大学黄硕教授、陈洪渊院士团队 研究发现苯硼酸修饰的 hetero-octamericMycobacterium smegmatis蛋白纳米孔(异源八聚耻垢分枝杆菌孔蛋白A纳米孔)，可以实现直接区分典型的核昔以及被修饰的核昔，如5-甲基胞昔、n6-甲基腺昔、n7-甲基鸟昔、n1-甲基腺音、肌昔、假尿昔和二氢尿昔。可以高效识别多种被修饰RNA片段，利用机器学习算法，可以实现对被修饰的RNA序列的识别，准确度达到0.996，可以被应用于microRNA和自然转移RNA的修饰的定量分析。

目前生物体内已知的RNA修饰大约170种类型，它们在各种生物代谢过程中是必不可少的，如基因编码、信使前 RNA (mRNA)剪接、mRNA输出、RNA折叠和染色质状态调节等。且越来越多的证据表明，大量的RNA修饰与癌症、神经系统疾病和其他人类疾病有关，因此可能被作为诊断标志物或治疗靶点新方法。

4）2019.6 Nature Biotechnology封面文章：纳米孔宏基因组实时快速测序技术，在6小时内准确识别下呼吸道病原体和抗生素抗性基因，比金标准更快！

2019.6 Nature Biotechnology封面文章：成功开发了首个使用纳米孔测序的快速、经济的宏基因组测序方法， 可从临床呼吸道样本中去除高达99.99%的宿主核酸，通过纳米孔测序技术的实时检测，在6小时内准确识别下呼吸道病原体和抗生素抗性基因。

英国东安格利亚大学的JustinO'Grady博士团队首先对来自疑似下呼吸道感染患者的40个样本进行了可行性研究。经过方法改进和优化后，对另外41个呼吸道样本进行测试。与培养法相比，优化的方法对病原体检测的敏感性为96.6%，特异性为41.7%，可以准确检测抗生素抗性基因。再经过定量PCR和pathobjont特异性基因分析后，特异性和灵敏度增加至100%，表明纳米孔宏基因组学可以在细菌细菌性下呼吸道感染研究中快速准确地鉴定病原菌，并可能助力减少广谱抗生素的使用。

每年全世界约有300万人死于肺炎等下呼吸道感染。目前，细菌性下呼吸道感染(LRIs)临床诊断的金标准一一细菌培养法周期慢且敏感性差。期间通常给与患者广谱抗生素治疗，但对于由抗性病原体引起的感染，治疗无效且有可能引发副作用。过量使用广谱抗生素还会加剧抗生素抗药性。相对干细菌培养，宏基因组测序可以更快地鉴定细菌性下呼吸道感染病原体。

5）2022.4 Nature Nanotechnology文章：基于纳米孔实时快速测序技术，开发出高度可调的DNA基膜纳米孔技术

英国伦敦大学学院Stefan Howorka等人研究表明：基于DNA的合理设计策略，可以极大地扩展膜纳米孔的结构和功能范围，纳米孔还可面向分析物定制形状和大小，从而有望改变利用固定尺寸纳米孔检测目标分析物的既有检测思路，并通过使用广泛的台式和手持分析设备直接检测纳米孔通道腔体中的单个蛋白质分子证明了该新型结构的实用性。设计的纳米孔阐释了DNA纳米技术是如何提供功能性生物分子结构以用于合成生物学、单分子酶学、生物物理分析、便携式诊断以及环境筛查等领域。

作者将DNA双链体束缚成孔结构亚单元，亚单元再进一步以模块化的方式排列，形成可调的孔形状和高达数十纳米的腔宽，设计的通道腔体可以是亚单元长度为10纳米的三角形（43 nm2），也可以是 亚单元长度为20纳米的正方形（400 nm2）。纳米孔结构具有用于定义形状的额外膜帽，通过定义亚单元的双链数目，膜帽的高度和宽度都可进行调整，帽亚单元之间由亚单元最内侧双链位置上的单链DNA进行连接，形状明确的膜帽结构可进一步决定负责跨膜的纳米孔桶形结构。通过位于亚单元膜帽下端的胆固醇锚接，桶形结构可穿透插入由典型脂质双分子层构成的膜以及MinION流动细胞，从而直接检测免疫相关蛋白质。

6）2018.8 《science》重磅有趣：基于纳米孔实时快速测序技术，开发出一种定向可控，持续性运行的纳米级分子送料斗（单足运料斗）（molecular hopper）无酶蛋白测序新技术！

牛津大学黑根·贝利（Hagan Bayley）庆雨佳博士等人，开发出一种定向可控，持续性运行送料的纳米级单脚跳分子，又叫单足运料斗（molecular hopper），以动态共价键方式沿蛋白轨道运行，运料斗运动受电压控制，具有定向性和持续性。在+150 mV下，对携带寡核苷酸的分子运料斗在不同轨道条件下运行进行实时监控分析。结果表明，他们的系统能够完全控制运料斗方向，并且创造了93min内在半胱氨酸轨道中前进249步的新纪录。

这个运料斗的方向受到外部电位的控制，轨道被“铺设”于蛋白质-a-溶血素（aHL）的纳米孔内，轨道“枕木”由一系列面向b-折叠桶内腔的半胱氨酸位点组成。每3个参与运料斗前进的硫原子以近线性构型排列，以执行SN2反应。运料斗通过硫醇-二硫化物交换反应定向运行。其装载的“货物”（DNA）受b-折叠桶内的电场力牵引前进。整个机制阻止了分子机器后退和跨步的发生，运料斗没有发现脱轨。运料斗的“脚”倾向于前进化的反应，导致每一步运行都是化学定向和自主的，不需要化学燃料。

第一作者说：导师推荐主课题花 80% 的时间，另外 20% 的时间可以用来尝试其他课题，甚至是一些疯狂的想法😄😄😄

7）2021.10 《J. Am. Chem. Soc.》文章：通过纳米孔实时快速测序中的化学步进进行无酶 DNA 碱基鉴定，提出了化学易位取代酶步进实现单分子生物聚合物测序的一种潜在方法

牛津大学黑根·贝利（Hagan Bayley）庆雨佳博士等人，利用该化学系统实现了DNA在纳米孔易位过程中顺序的碱基识别。

纳米孔的原型是在经典的α-溶血素(αHL)孔内的β链上均匀分布一系列半胱氨酸位点， 而“hopper”的运动是在跨膜电位下通过连续的硫醇-二硫交换反应完成。每次步进反应具有严格的区域选择性，使“hopper”始终被束缚在轨道上，同时具有高度的方向性。作者将感兴趣的DNA序列通过二硫键与含有traptavidin-binder的多肽载体结合，首先将DNA - 多肽偶联物从顺式一端穿入具有五个半胱氨酸轨道的蛋白质纳米孔αHL。末端的traptavidin阻滞剂阻止了易位，随后DNA通过一个立足点半胱氨酸侧链和二硫键之间的硫醇-二硫键交换共价连接到纳米孔壁。应用跨膜电位来控制DNA的运动方向，通过改变电压的正负，DNA可以从轨道的一端反复移动到另一端。纳米孔的离子电流既可以反映出样品在小孔中的位置，也反映出DNA的序列。

8）2023.4 《Genome Research》：Oxford Nanopour 纳米孔实时快速测序技术，选择性测序富集微生物组中稀有/未知基因组

南方科技大学夏雨研究团队：利用0xford Nanopore适应性采样技术，通过-段短时间的正常测序，确定出群落的大致结构和高丰度物种的组成，以形成进行选择性测序所需的参考序列。将metaRUpore应用于高温庆氧反应器(thermophilic anaerobic digester, TAD)群落和人类肠道微生物群落，metaRUpore成功将测序通量从高丰度种群转移到稀有物种，并促进了稀有物种的高质量基因组 (high-quality metagenome-assembled genomes,HQ-MAGs)的组装。该方法简捷且稳定，适用于具有中等计算资源的实验室，并有可能成为未来对复杂微生物群落进行 宏基因组Q纳米孔测序的标准方法。

9）《Genome Biology》：0xford Nanopore纳米孔实时快速测序技术，可用于检测cfDNA的细胞起源和癌症特异性甲基化特征！

以色列希伯来大学等单位的研究人员：进行了循环肿瘤DNA（ctDNA）ONT测序的可行性研究，基于ONT全基因组测序检测癌症患者ctDNA的拷贝数变异（CNA），并通过比较ONT测序与Illumina测序平台得获得的甲基化和片段特征信息，证实了ONT测序可成为液体活检的有力工具。

10）2021.4 《Nature Methods》：利用纳米孔实时快速测序技术，同时检测多种细菌DNA甲基化motifs，并利用细菌DNA甲基化多样性增强菌群分析清晰度，新方法使纳米孔测序广泛适用的细菌甲基化发现，为发现新的靶点设计新的抑制剂提供了新的机会！

西奈山伊坎医学院房刚课题组，开发了新方法NanoDisco，利用纳米孔测序同时检测多种细菌DNA甲基化motifs，并利用细菌DNA甲基化多样性增强菌群分析清晰度。新开发的NanoDisco分析方法，使纳米孔测序广泛适用的甲基化发现。我们将其应用于单个细菌和肠道微生物群，以获得可靠的甲基化发现。

细菌DNA甲基化在调节细菌的毒力、产孢、生物膜形成、病原与宿主相互作用等生理功能方面发挥着重要作用。新方法使研究人员能够更有效地发现细菌病原体的新型DNA甲基化，为发现新的靶点设计新的抑制剂提供了新的机会。

11）2021.1 《Nature Communications》：纳米孔实时快速测序技术，高错误区域恢复率高达99% ！

中山大学中山眼科中心肖传乐/刘奕志团队和中南大学王建新团队：收集了多种模式生物Nanopore数据集进行性能测试，结果表明: NECAT校正后序列平均精度可达95-98%，可恢复原始数据中99%的高错误局部区域(HERS ，从而保留了序列长度完整性(表1;NECAT组装完整性明显高于同类校正组装软件，且维装错误量显著低于同类软件。另外，研究者将NECAT校正结果与多个组装软件结合使用发现，NECAT校下结果能显著提高其它Nanopore组装软件的组装质量。

12）2022《Nature Biotechnology》：Nanopore实时测序技术，超快速识别基因组致病变异，比当下报道的最快基因组诊断时间（14:33h）还快50%！将极大加速临床基因组测序的诊断！

斯坦福大学Euan A. Ashley教授团队：开发了一种精简的纳米孔WGS方法(pipeline)，应用于临床诊断，在抽血后8 h内获得一个候选变异，相较于迄今为止最快的时间（样品制备到变异鉴定），缩短了46%-50%！！！

该WGS方法能够在<2h内生成高深度的人类全基因组数据，<8h内生成诊断性变异调用，已证明比之前报道的14:33h内最快的基因组诊断速度快50%。

纳米孔测序方法，可以在低复杂度区域外和医学相关基因内生成高质量的变异调用，并且在GIAB高置信度区域之外，变体调用也具有很高的一致性。纳米孔测序的另一个优势是能够直接从原始信号中获得甲基化信息！

13）2020.11 《Nature Methods》：纳米孔实时快速测序技术，可同时获取染色质可及性和甲基化信息！

2020.11 约翰霍普金斯大学Winston Timp教授研究团队，基于纳米孔测序技术开发出一种能够同时检测CpG甲基化和染色质可及性的测序方法——nanoNOMe-seq，构建了涵盖甲基化和染色质开放性信息等在内的人类细胞表观基因组，并利用该技术揭示了乳腺癌细胞和非癌细胞间的表观遗传差异。

该技术具有的单分子分辨率实现了对染色质上蛋白质结合和核小体足迹的追踪，并能确定启动子附近区域的表观遗传特征，使在单分子水平上构建由复杂表观遗传信息构成的人类表观基因组成为可能，为我们揭示人类发育与疾病发生中复杂的染色质表观遗传学特征提供了新的技术支持。

14）2022.6 《Nature Communications》：纳米孔实时快速测序技术，快速解析肠道菌群结构变异和功能

肠道微生物组已成为生命科学研究热点，但目前大部分研究都集中在使用二代测序技术进行物种和功能的解析，宏基因组的拼接质量不高并且很难实现菌株水平的功能差异分析。

中科院微生物研究所王军博士和中科院动物研究所宋默识博士团队，采用Oxford Nanopore纳米孔实时快速测序技术，对肠道微生物宏基因组研究，更快速、完整、准确分析了肠道菌群的结构变异与功能。

15）2023.11《eBioMedicine》：北大人民医院大队列研究表明，纳米孔实时快速测序技术能够快速准确诊断下呼吸道感染！

北大人民医院王辉团队，通过纳米孔实时快速测序技术+大队列研究，快速准确鉴定确诊断下呼吸道感染。他们开发出靶向和无偏宏基因组结合的双流程纳米孔测序技术，测序分析了多中心收集了450例下呼吸道标本，Findings 宏流程对细菌、真菌（除曲霉属）和结核分枝杆菌组的检出分别达到82.9%、88.7%和75.0%的高灵敏度。与宏流程相比，靶向流程的扩增提高了病毒（>80.0% vs. 39.4%）和曲霉属（81.8% vs. 42.3%）检测的灵敏度。与复合标准相比，NanoMP总体实现了80.2%的灵敏度和98.8%的特异性，并且能够准确检测包括blaKPC-2、blaOXA-23和mecA在内AMR基因并能够进行溯源。

16）2022.11 《Water Research》 [IF 13.4] ：纳米孔实时快速测序宏基因组，揭示污水受纳水体耐药菌/基因特征及耐药基因富集机制

南方科技大学环境科学与工程学院夏雨博士团队，利用纳米孔实时快速测序技术，对污水厂出水受纳水体中的耐药基因及其细菌宿主携带者的进行快速检测，并且自主开发了一个快速检测耐药基因和细菌宿主的宏基因组学分析工具ARGPore2（https://github.com/sustc-xylab/ARGpore2），实现了对耐药细菌及所携带耐药基因的精准检测。

同时，该方法能应用于复杂的环境样品，能对环境中爆发的病原菌及其耐药基因的进行有效的监测和预防。

17）2020.6 《small》:  武大团队，纳米孔实时快速测序技术，快速靶向测序法、准确、全面检测SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒，最快10分钟“捕获”新冠病毒

武汉大学药学院刘天罡教授、武汉大学人民医院李艳教授等研究者，创新性开发了纳米孔靶向测序（NTS）检测方法。NTS结合了病毒靶向扩增和纳米孔测序长读长、实时数据输出的优势，首次实现测序后4小时内高敏感性、高准确性同时检测SARS-CoV-2和其他10大类、40种呼吸道病毒，其最低检测限高于目前广泛使用的qPCR的100倍。同时，该法还可实现对新型冠状病毒基因组变异情况进行检测，监控病毒变异引起的毒性与传播能力改变的情况。

相比传统qPCR方法，仅针对病毒基因组上2-3个位点进行检测分析，覆盖<0.5%病毒基因组，样本在采样、存储、检测过程发生中稍有偏差，会导致仅针对少数基因位点的PCR检测手段的效率降低，甚至漏检，造成“假阴性”，且检测区域一旦发生变异，会造成检测结果失效。

研究结果表明，NTS方法优于比qPCR法，阳性检出率提升43.8%！ 

对于高浓度病毒样本，NTS仅需测序10分钟即可检测阳性！

即使极低浓度病毒样本，也仅需测序4小时完成检测，从收到样本到出具结果，全程控制在6-10小时，且纳米孔测序平台对实验室要求不高，其中最小测序仪MinION是便携式，适合不同级别的医院使用。

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